SPR技術(shù)原理

SPR技術(shù)，也就是表面等離子共振，本質(zhì)上是個(gè)光學(xué)現(xiàn)象，發(fā)生在兩種不同折射率的介質(zhì)之間，中間夾了一層薄薄的金屬膜。當(dāng)光從高折射率介質(zhì)比如玻璃，通過(guò)一個(gè)棱鏡射到這個(gè)金屬膜表面時(shí)，如果角度或者波長(zhǎng)剛好對(duì)上，就會(huì)發(fā)生全內(nèi)反射，把金屬里的自由電子給攪動(dòng)起來(lái)，形成一種叫表面等離子體的東西。這會(huì)生成一種能量衰減很快的隱矢波，沿著金屬表面跑。神奇的是，在特定的角度下，你會(huì)發(fā)現(xiàn)反射光的強(qiáng)度突然掉下來(lái)，甚至變成零，這就是所謂的SPR角。這個(gè)角特別敏感，只要金屬膜表面沾點(diǎn)東西，哪怕只是分子量的變化，它都會(huì)跟著變。所以，我們就能利用這個(gè)特性來(lái)研究生物分子之間的相互作用了。

具體是怎么操作的呢？核心就是利用剛才說(shuō)的那個(gè)SPR角對(duì)表面變化的敏感性。兩個(gè)分子結(jié)合了，或者解離了，表面質(zhì)量肯定會(huì)變一點(diǎn)點(diǎn)，SPR就能捕捉到這種微小的變化，然后把它放大成我們可以測(cè)量的信號(hào)。利用這個(gè)原理，GE公司就開(kāi)發(fā)出了像Biacore T200這樣的儀器。它的核心部件包括一個(gè)精密的SPR光學(xué)檢測(cè)器、一個(gè)負(fù)責(zé)控制液體流動(dòng)的微流控系統(tǒng)IFC，還有就是我們實(shí)驗(yàn)的舞臺(tái)，傳感芯片。工作的時(shí)候，光線從玻璃層穿過(guò)金屬膜，照到樣品池里。如果你的配體已經(jīng)固定在金屬膜上了，當(dāng)分析物流過(guò)時(shí)，它們結(jié)合會(huì)改變樣品池的折射率，SPR角就變了，光學(xué)檢測(cè)器就能讀出這個(gè)變化，變成信號(hào)值。這就像一個(gè)超級(jí)靈敏的天平，能稱出皮克級(jí)別的物質(zhì)變化，而且是實(shí)時(shí)的，不需要加標(biāo)簽，親和力范圍也覆蓋得非常廣，從納摩爾到毫摩爾都能搞定。

SPR實(shí)驗(yàn)流程

那么，一個(gè)典型的SPR實(shí)驗(yàn)是怎么做的呢？其實(shí)主要就三步，第一步叫偶聯(lián)，就是先把你要研究的那個(gè)分子，我們叫它配體，牢牢地固定在芯片表面。第二步是結(jié)合解離，讓另一個(gè)分子，也就是分析物，流過(guò)芯片表面，看看它們?cè)趺唇Y(jié)合，又怎么分開(kāi)。第三步是再生，把結(jié)合上去的分析物清理掉，這樣芯片就能重復(fù)使用了。

第一步，偶聯(lián)有兩種主流方式。一種是直接偶聯(lián)，最常見(jiàn)的是氨基偶聯(lián)，直接把帶氨基的配體固定上去。另一種是間接偶聯(lián)，也叫捕獲法，先用一個(gè)捕獲分子把芯片表面占住，然后利用這個(gè)捕獲分子和你真正想固定的配體之間的親和力關(guān)系，把配體拉上去。這里面有個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，就是配體的偶聯(lián)量，通常用Rmax表示，它決定了你的芯片能容納多少分析物。這個(gè)量不是越高越好，做動(dòng)力學(xué)分析時(shí)太密了反而不好，會(huì)影響擴(kuò)散。當(dāng)然，偶聯(lián)結(jié)束，你得檢查一下，看看這些配體是不是活性還在，因?yàn)榕悸?lián)過(guò)程可能影響配體活性。

接下來(lái)是重頭戲，結(jié)合解離。現(xiàn)在配體已經(jīng)固定在芯片上，輪到分析物出場(chǎng)了。我們讓一系列不同濃度的分析物依次流過(guò)芯片表面，SPR儀器就會(huì)實(shí)時(shí)記錄下信號(hào)的變化，畫(huà)出一條曲線，這就是傳感圖。為了得到干凈的結(jié)果，我們通常會(huì)用雙扣除的方法，就是把你的實(shí)驗(yàn)通道信號(hào)減去一個(gè)參比通道的信號(hào)，再減去零濃度分析物時(shí)的信號(hào)。為什么要這么做？因?yàn)橛袝r(shí)候分析物可能會(huì)非特異性地粘在芯片上，或者芯片本身信號(hào)有漂移，這些都會(huì)干擾結(jié)果。

參比通道就像是對(duì)照組，幫我們把這些雜音去掉。做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候也要留心觀察響應(yīng)值，如果結(jié)合信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了理論上的最大值Rmax，那可能就是分析物濃度算錯(cuò)了、自己抱團(tuán)聚集了，或者發(fā)生了不該發(fā)生的非特異性吸附。反過(guò)來(lái)，如果信號(hào)低得可憐，那可能就是分析物濃度太低，或者你的配體根本就沒(méi)活性了。

做完一輪結(jié)合解離實(shí)驗(yàn)，芯片表面就布滿了分析物，不能再用了。這時(shí)候就需要再生步驟，把它們清理干凈。大多數(shù)分子間的相互作用都是非共價(jià)的，比如氫鍵、離子鍵這些，所以我們可以通過(guò)一些化學(xué)或物理手段把它們破壞掉，讓分析物從配體上脫落下來(lái)。理想的再生當(dāng)然是既能把分析物徹底清除，又不會(huì)傷及配體一根毫毛。常用的再生試劑五花八門(mén)，比如對(duì)付抗體和蛋白質(zhì)，常用的是酸性條件，像pH 1.5到3.0的甘氨酸溶液，酸性足夠強(qiáng)，能把很多非共價(jià)鍵打斷。對(duì)付核酸或者糖類，可能就需要堿性條件了。還有高鹽溶液、表面活性劑、乙醇這些，各有各的用處。怎么知道再生效果好不好呢？很簡(jiǎn)單，對(duì)比一下再生前和再生后的基線信號(hào)，如果信號(hào)恢復(fù)到了接近初始狀態(tài)，那就說(shuō)明再生得比較干凈。如果不行，那就得回去調(diào)整再生條件了。

SPR技術(shù)在抗體藥物生命周期中的角色

SPR在抗體藥物整個(gè)生命周期里都能大顯身手。在早期研發(fā)階段，你想篩選出最好的抗體候選分子，SPR就能幫你快速評(píng)估它們跟目標(biāo)抗原的結(jié)合能力。到了生產(chǎn)階段，需要對(duì)最終的抗體藥物進(jìn)行詳細(xì)的表征，比如搞清楚它到底結(jié)合了哪個(gè)表位，親和力有多強(qiáng)，活性成分有多少等等，SPR都是得力助手。更進(jìn)一步，到了后期的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)，只要我們建立了一套靠譜的系統(tǒng)適用性標(biāo)準(zhǔn)，SPR完全可以用來(lái)做方法學(xué)驗(yàn)證，參與產(chǎn)品的最終放行和穩(wěn)定性研究。

總之，表面等離子共振技術(shù)憑借其獨(dú)特的光學(xué)原理和高靈敏度，已經(jīng)成為研究生物分子相互作用的強(qiáng)大工具。貫穿了抗體藥物從研發(fā)到生產(chǎn)的全過(guò)程，不僅能提供詳細(xì)的親和力數(shù)據(jù)，更重要的是能揭示結(jié)合和解離的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，幫助我們深入理解分子機(jī)制。隨著技術(shù)的發(fā)展和方法驗(yàn)證的完善，SPR在未來(lái)的藥物研發(fā)和質(zhì)量控制中必將扮演越來(lái)越重要的角色。

       原文標(biāo)題 : 表面等離子共振（SPR）技術(shù)概述