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引言

單克隆抗體作為生物制藥領(lǐng)域的關(guān)鍵分子，它的質(zhì)量控制直接關(guān)系到治療效果和患者安全。電荷異質(zhì)性作為單克隆抗體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，直接影響藥物的穩(wěn)定性、吸收效果、在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間等等。電荷異質(zhì)性受到多種因素的影響，例如生產(chǎn)過程中發(fā)生的各種翻譯后修飾，包括脫酰胺、糖基化、氧化這些化學(xué)反應(yīng)，讓抗體分子帶上不同的電荷，形成了酸性、堿性變異體。監(jiān)管機(jī)構(gòu)像FDA、EMA對(duì)這方面規(guī)定非常嚴(yán)格。所以，怎么控制住這個(gè)電荷異質(zhì)性，就成了保證單抗質(zhì)量和療效的關(guān)鍵。

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一、電荷異質(zhì)性的來源和影響

電荷異質(zhì)性到底是什么？簡單說，就是一批單克隆抗體里面，有些分子帶的電荷多一點(diǎn)，有些少一點(diǎn)，有些還是中性的。根據(jù)電荷多少，我們可以把它們分成三大類：主物種、酸性物種和堿性物種。主物種就是我們想要的那個(gè)主要成分，通常為色譜分析中的主峰�？赡馨�含常見修飾（如N端焦谷氨酸化、C端賴氨酸缺失、CH2域天冬酰胺位點(diǎn)的中性聚糖）。麻煩的是后面兩類。酸性物種，顧名思義，它們帶的負(fù)電荷更多，在等電點(diǎn)上更靠前。主要源于天冬酰胺殘基的脫酰胺作用（pH升高、溫度升高加速），也來自糖鏈唾液酸化、糖基化、末端酸性基團(tuán)。另一類是堿性物種，它們帶的正電荷更多。源于C端賴氨酸未完全去除、C端酰胺化、琥珀酰亞胺形成、N端谷氨酸轉(zhuǎn)化或其他結(jié)構(gòu)變化。這些變異體的比例不是一成不變的，生產(chǎn)過程、用的細(xì)胞系、甚至儲(chǔ)存條件都會(huì)影響它們的含量。

這些電荷變異體，哪怕含量很低，也可能會(huì)影響藥物的療效、穩(wěn)定性，甚至可能引發(fā)免疫反應(yīng)。具體來說，它們會(huì)影響藥物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)PK和藥效動(dòng)力學(xué)PD，也就是藥物怎么被吸收、分布、代謝和排泄，以及它怎么發(fā)揮療效。比如說，酸性變異體可能會(huì)降低抗體跟靶點(diǎn)結(jié)合的能力，那藥效自然就下降了。反過來，堿性變異體可能會(huì)改變抗體跟Fc受體的相互作用，這可能讓藥物在體內(nèi)停留的時(shí)間變短，或者更糟糕，引起一些不希望看到的免疫反應(yīng)。

總之，這些變異體會(huì)增加批次間的差異，讓生產(chǎn)和質(zhì)量控制變得更復(fù)雜，審批也更難通過。正因?yàn)槿绱�，監(jiān)管機(jī)構(gòu)像FDA和EMA才會(huì)把電荷異質(zhì)性列為關(guān)鍵質(zhì)量屬性，必須嚴(yán)格控制。所以，我們的目標(biāo)很明確，要想辦法把這些變異體降到最低，確保生產(chǎn)出的單抗既有效又安全，批次之間高度一致，這樣才能實(shí)現(xiàn)可靠、可大規(guī)模生產(chǎn)的高質(zhì)量生物藥。

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二、分析電荷變異體的技術(shù)

要想知道電荷變異體有多少，得靠精密的儀器。目前主流的技術(shù)有這么幾種。首先是毛細(xì)管等電聚焦，cIEF。它能根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI把它們分開，分辨率非常高，是分析酸性、堿性和主物種的必備工具。其次是離子交換色譜，特別是陽離子交換色譜，CEX。它利用不同分子表面電荷的細(xì)微差別來進(jìn)行分離，通過精確控制pH和鹽濃度的變化，能把各種電荷狀態(tài)的分子區(qū)分開來。還有液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，LC-MS。這不僅能分離，還能告訴你每個(gè)組分的具體結(jié)構(gòu)信息，比如有哪些PTM，這對(duì)于理解電荷差異的原因很有幫助。此外，還有一些輔助技術(shù)，比如電噴霧電離ESI和詳細(xì)的肽圖譜分析，能提供更深入的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。當(dāng)然，科技在進(jìn)步，現(xiàn)在還有更先進(jìn)的技術(shù)出現(xiàn)，比如成像毛細(xì)管IEF，icIEF，和集成的色譜質(zhì)譜方法，它們能提供更高的靈敏度和分辨率。

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三、電荷異質(zhì)性的優(yōu)化

單克隆抗體開發(fā)中電荷異質(zhì)性的優(yōu)化主要分兩大塊，培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分。

培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件的優(yōu)化包括溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間長短、光照、溶解氧等等。溫度是個(gè)關(guān)鍵因素。一般來說，把培養(yǎng)溫度降下來，比如降到32到34攝氏度，可以減慢細(xì)胞的代謝速度，也能減緩像脫酰胺這種非酶反應(yīng)的速度，這樣就能減少酸性物種的生成。但是另一方面，溫度太低可能會(huì)影響某些酶的活性，比如負(fù)責(zé)切除C端賴氨酸的羧肽酶，導(dǎo)致賴氨酸切不干凈，反而增加了堿性變異體。所以，溫度需要仔細(xì)調(diào)控。pH相對(duì)容易控制一些。pH越高，通常脫酰胺反應(yīng)越快，唾液酸化反而會(huì)減少，結(jié)果就是酸性物種增多。反過來，降低pH呢，可能會(huì)促進(jìn)唾液酸化，同時(shí)讓N端的谷氨酰胺更容易環(huán)化成焦谷氨酸，這就有利于形成堿性物種。

除了溫度和pH，還有其他因素也會(huì)影響電荷異質(zhì)性。比如培養(yǎng)時(shí)間，一般來說，培養(yǎng)時(shí)間越長，比如從第五天延長到第十四天，細(xì)胞經(jīng)歷的時(shí)間更長，各種翻譯后修飾PTM就有更多積累的機(jī)會(huì)，結(jié)果就是酸性變異體的比例可能會(huì)增加。還有環(huán)境因素，比如光照。普通的光線照射也可能導(dǎo)致抗體上某些氨基酸殘基，比如色氨酸，發(fā)生氧化反應(yīng)。另外，培養(yǎng)基里的溶解氣體，主要是二氧化碳和氧氣，它們的濃度也會(huì)影響細(xì)胞的代謝狀態(tài)，進(jìn)而影響產(chǎn)物的質(zhì)量。不過，這里要強(qiáng)調(diào)一點(diǎn)，有時(shí)候關(guān)于同一個(gè)參數(shù)的影響，不同研究可能會(huì)得出相反的結(jié)論。這并不是說研究錯(cuò)了，而是因?yàn)樯�物過程本身就非常復(fù)雜！不同的細(xì)胞系、不同的抗體分子結(jié)構(gòu)、不同的培養(yǎng)基配方，甚至不同的操作方式，都可能導(dǎo)致結(jié)果不一樣。這恰恰說明，我們不能想當(dāng)然地套用別人的經(jīng)驗(yàn)，必須基于自己的數(shù)據(jù)，針對(duì)具體情況制定優(yōu)化策略。這也就是為什么現(xiàn)在越來越強(qiáng)調(diào)數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的工藝開發(fā)。

培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基里的成分，每一種都可能扮演著重要角色。比如葡萄糖，這是細(xì)胞的主要能量來源，但如果濃度過高，超過15克每升，它就可能通過非酶糖基化途徑，促進(jìn)酸性物種的形成，還會(huì)影響糖鏈上唾液酸的分布。微量金屬，像鐵、錳，它們是很多參與PTM的酶的必需輔因子，比如負(fù)責(zé)切C端賴氨酸的羧肽酶、負(fù)責(zé)酰胺化的酶、還有糖基化相關(guān)的酶，都離不開它們。但同時(shí)，它們也可能催化氧化反應(yīng)，所以得小心用量。銅就是一個(gè)例子，稍微多一點(diǎn)，可能催化氧化反應(yīng)，增加電荷異質(zhì)性。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本模塊，但也直接參與修飾。比如天冬酰胺，本身就是脫酰胺反應(yīng)的底物；精氨酸可能被甲基乙二醛這些分子修飾；賴氨酸則關(guān)系到C端賴氨酸的殘留和糖基化。還有各種維生素、補(bǔ)充劑、水解物、丁酸鈉等等，這些成分可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝狀態(tài)、氧化還原平衡，是抗氧化還是促氧化，甚至直接影響那些PTM酶的活性。

傳統(tǒng)優(yōu)化方法

歷史上，優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分一直是控制電荷異質(zhì)性的主要手段。常用的方法主要有這么幾種。單因素法，就是一次只改一個(gè)條件，其他都固定住。這種方法簡單直接，但最大的問題是它看不到變量之間的相互作用。于是后來就有了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，DOE，它能讓你同時(shí)改變好幾個(gè)因素，還能分析它們之間的交互影響。但即便如此，當(dāng)變量一多，或者生物系統(tǒng)的反應(yīng)特別復(fù)雜、非線性的時(shí)候，DOE也常常感到力不從心。后來人們又引入了統(tǒng)計(jì)建模，比如多元數(shù)據(jù)分析，MVDA，用主成分分析、偏最小二乘法這些工具，希望能從一大堆數(shù)據(jù)里找出隱藏的模式和關(guān)聯(lián)。但這種方法通常需要大量的數(shù)據(jù)，而且它背后的數(shù)學(xué)模型大多是基于線性假設(shè)的，而生物系統(tǒng)非線性是常態(tài)。所以，MVDA在捕捉那些復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的PTM變化時(shí)，準(zhǔn)確性還是有限。還有系統(tǒng)生物學(xué)，試圖從更根本的層面理解細(xì)胞，但它太復(fù)雜了，需要的數(shù)據(jù)量巨大，而且往往很難直接告訴你，為了減少電荷變異，我應(yīng)該具體怎么做。

所以，總結(jié)一下，這些傳統(tǒng)方法在穩(wěn)定一些基本參數(shù)方面還不錯(cuò)，但對(duì)于解決像電荷異質(zhì)性這種由一大堆復(fù)雜因素相互作用導(dǎo)致的問題，就顯得有點(diǎn)不夠用了。我們需要更強(qiáng)大的武器，這就是機(jī)器學(xué)習(xí)ML要登場(chǎng)的地方了。

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四、機(jī)器學(xué)習(xí)在生物工藝中的應(yīng)用

面對(duì)傳統(tǒng)方法在優(yōu)化生物工藝時(shí)遇到的瓶頸，特別是那些復(fù)雜的非線性交互作用和海量的數(shù)據(jù)，機(jī)器學(xué)習(xí)ML就派上大用場(chǎng)了。ML是人工智能的一個(gè)分支，它的核心思想是讓計(jì)算機(jī)通過學(xué)習(xí)數(shù)據(jù)中的模式來進(jìn)行預(yù)測(cè)或決策。

在生物制藥領(lǐng)域，ML主要有這么用法：第一種是監(jiān)督學(xué)習(xí)，這是最常用的，使用標(biāo)記數(shù)據(jù)集 (比如輸入: 溫度、pH、營養(yǎng)濃度; 輸出: 滴度、變異體比例)。監(jiān)督學(xué)習(xí)又分兩種：回歸和分類�；貧w是用來預(yù)測(cè)連續(xù)值的，比如預(yù)測(cè)具體的產(chǎn)量是多少，或者酸性變異體占百分之多少。常用的算法有支持向量回歸、隨機(jī)森林、梯度提升等等。分類則是把東西分成不同的類別，比如把一個(gè)批次的電荷譜型分成合格或不合格。常用的算法有決策樹、支持向量機(jī)，還有像隨機(jī)森林、梯度提升這種既可以做回歸也可以做分類的集成模型。

第二種是無監(jiān)督學(xué)習(xí)，它不需要標(biāo)簽，而是自己去發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)里的隱藏結(jié)構(gòu)。比如聚類，它可以幫你把相似的培養(yǎng)條件組合歸為一類，看看哪些條件經(jīng)常一起出現(xiàn)，或者幫你找到代謝上的瓶頸。還有主成分分析PCA能把維度很高的數(shù)據(jù)降維，讓你更容易看懂?dāng)?shù)據(jù)背后的主要矛盾，比如揭示培養(yǎng)基里哪些成分跟糖基化模式關(guān)系最密切。

第三種是強(qiáng)化學(xué)習(xí)，這個(gè)比較新，它像訓(xùn)練一樣，通過獎(jiǎng)勵(lì)和懲罰，以基于反饋的方法來學(xué)習(xí)最優(yōu)策略，特別適合做動(dòng)態(tài)優(yōu)化。

總之，ML提供了各種強(qiáng)大的工具，來應(yīng)對(duì)生物工藝優(yōu)化的復(fù)雜性。

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五、展望未來：Bioprocessing 4.0 與智能工廠

機(jī)器學(xué)習(xí)在生物工藝?yán)锏膽?yīng)用非常廣泛。首先，它可以用來預(yù)測(cè)關(guān)鍵性能指標(biāo)，KPI，比如產(chǎn)量滴度，或者關(guān)鍵工藝參數(shù)，CPP，比如某個(gè)特定變異體的比例。像人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)ANN、卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)CNN、長短期記憶網(wǎng)絡(luò)LSTM這些深度學(xué)習(xí)模型，已經(jīng)被成功用于模擬和優(yōu)化CHO細(xì)胞的培養(yǎng)過程，可以提高生產(chǎn)率 15-25%。

其次，在培養(yǎng)基開發(fā)和優(yōu)化方面，ML也很有用�？梢杂枚嘣�分析或者主動(dòng)學(xué)習(xí)的策略，比如用梯度提升決策樹，來找出哪些培養(yǎng)基成分最重要，然后調(diào)整它們的濃度，提高細(xì)胞的生長和生產(chǎn)效率。甚至可以預(yù)測(cè)培養(yǎng)過程中某些關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)比如氨基酸的動(dòng)態(tài)消耗情況，或者搞清楚像酵母提取物這種復(fù)雜成分到底對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)有什么影響。更重要的是，ML不只是靜態(tài)地優(yōu)化一個(gè)終點(diǎn)結(jié)果，它還能進(jìn)行動(dòng)態(tài)優(yōu)化。也就是說，在培養(yǎng)過程中，它可以實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)，然后動(dòng)態(tài)地調(diào)整培養(yǎng)條件，比如溫度、pH、補(bǔ)料策略，來維持產(chǎn)品質(zhì)量比如電荷異質(zhì)性在一個(gè)理想的范圍內(nèi)，同時(shí)還要平衡產(chǎn)量和質(zhì)量這兩個(gè)目標(biāo)。

最近還有研究把ML和過程分析技術(shù)PAT結(jié)合起來，比如用拉曼光譜這種在線監(jiān)測(cè)手段，實(shí)時(shí)獲取數(shù)據(jù)，然后喂給ML模型，讓模型去建立上游條件和下游產(chǎn)品質(zhì)量比如糖基化、電荷異質(zhì)性之間的聯(lián)系，從而實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的上游控制。這完全符合質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的理念，用數(shù)據(jù)說話，提前控制。

展望未來，這些計(jì)算方法，特別是機(jī)器學(xué)習(xí)，正在被越來越廣泛地采納，目標(biāo)是構(gòu)建一個(gè)生物制藥的智能工廠。在所謂的Bioprocessing 4.0時(shí)代，基于機(jī)器學(xué)習(xí)的技術(shù)將扮演核心角色。這些數(shù)字AI就像生物工廠的虛擬化身，它們會(huì)持續(xù)不斷地分析PAT流數(shù)據(jù)和各種操作數(shù)據(jù)，然后在計(jì)算機(jī)里模擬和優(yōu)化生產(chǎn)的每一個(gè)環(huán)節(jié)，無論是上游還是下游。未來的趨勢(shì)是，實(shí)時(shí)的預(yù)測(cè)性控制將取代傳統(tǒng)的終點(diǎn)測(cè)試。生物反應(yīng)器會(huì)根據(jù)模型的建議，自動(dòng)調(diào)整設(shè)置，把關(guān)鍵質(zhì)量屬性始終控制在非常精確的范圍內(nèi)。這樣一來，批次間的差異就會(huì)大大減少，生產(chǎn)失敗的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)隨之降低。更進(jìn)一步，從這個(gè)過程中獲得的深刻見解，還可以反過來指導(dǎo)我們進(jìn)行更合理的細(xì)胞系設(shè)計(jì)和培養(yǎng)基設(shè)計(jì)，把穩(wěn)健的電荷譜特性從一開始就嵌入到產(chǎn)品開發(fā)的源頭。

所有這些創(chuàng)新最終都將帶來實(shí)實(shí)在在的好處。生產(chǎn)出的藥物更加穩(wěn)定，生產(chǎn)成本更低，上市時(shí)間更快，而且能夠惠及全球更多有需要的人。最終的目標(biāo)是，讓高質(zhì)量的生物制劑變得更加經(jīng)濟(jì)、更容易規(guī)�；�生產(chǎn)，并且能夠更快地響應(yīng)不斷出現(xiàn)的健康挑戰(zhàn)。

參考文獻(xiàn)：

1.Machine learning-driven optimization of culture conditions and media components to mitigate charge heterogeneity in monoclonal antibody production: current advances and future perspectives. MAbs.2025 Dec;17(1):2547084.

       原文標(biāo)題 : 單克隆抗體開發(fā)中的電荷異質(zhì)性