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引言

抗體與其靶抗原的結合動力學是決定其生物學功能和作為新型生物治療藥物成功的關鍵因素。定義抗原抗體的相互作用和動力學對于理解抗體在治療應用中的藥理學和藥效學特征至關重要。

抗體的功能與其結構直接相關，不同的結構域能夠與抗原和免疫系統(tǒng)的其他元件相互作用。天然抗體由兩個片段抗原結合結構域（Fab）和一個片段可結晶結構域（Fc）組成。Fab結構域包含互補決定區(qū)（CDR），其通過非共價相互作用介導抗體與靶標的結合。傳統(tǒng)上，兩個抗體臂上的CDR是相同的，但目前已經(jīng)開發(fā)出多種新的形式，包括雙特異性抗體、三特異性抗體、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）和免疫細胞因子等。

精準確定抗體結合相互作用是早期發(fā)現(xiàn)工作的關鍵，靶點的性質和候選抗體的適應癥應用可能決定親和力要求和靶點作用機制。與小分子不同，抗體可以與幾個治療靶點（包括Fc受體）相互作用，導致免疫效應細胞的募集和激活，直接消除表達靶抗原的細胞。抗體還可以通過模仿天然多價配體、驅動受體聚集和反激活來誘導激動作用。這些不同的作用機制和日益復雜的新型抗體形式的出現(xiàn)，使抗體親和力和功能效力之間關系的研究成為一項復雜的任務。

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一、抗體結合親和力與功能性親和力

結合親和力（affinity）代表了兩個分子之間結合的緊密程度。它來源于結合和解離的速率，定義了復雜結構的組裝和分解的速度。在抗體的背景下，靶結合親和力是指CDR與其抗原表位之間的相互作用，它來自抗體與靶標解離速率常數(shù)（Koff）和結合速率常數(shù)（Kon）的比值。

結合親和力也可以來自其他抗體結構域，如Fc區(qū)。由于這些恒定結構域的高度序列同源性，相互作用強度通常是一致的，主要在抗體同種型或Fc受體多態(tài)性之間觀察到顯著差異�？贵w對其抗原的親和力和特異性是由非共價相互作用驅動的，包括氫鍵、范德華力和抗體CDR中氨基酸殘基介導的靜電相互作用。具有相似結合親和力的抗體可能具有不同的動力學。因此，在考慮觀察到的治療效果時，了解影響KD值的個體動力學速率常數(shù)是非常重要的。

由于抗體的二價形式，抗體同時與兩種不同的抗原結合，這一概念被稱為功能性親和力（avidity）。功能性親和力代表抗體-抗原相互作用的整體強度，受三個因素的影響——結合親和力（Affinity）、價數(shù)和抗體與抗原的結構排列。功能性親和力來源于結合位點的共定位，抗體的兩個CDR結合到同一靶標上，如細胞膜上的抗原。這可以表現(xiàn)為結合親和力的明顯增加，這是由增強的再結合潛力引起的，因為第二個Fab：抗原相互作用可以在主要復合物解離之前發(fā)生。

親和力增加可能出于兩個原因。首先，抗體的兩個臂都與空間相關的位點結合，為了完全解離，兩個臂必須釋放其抗原，導致有效的解離半衰期比單獨的抗體臂長得多。其次，當與細胞表面相關抗原結合時，抗體在空間上受到限制。一個潛在的后果是，第二次結合事件是由細胞表面上第二拷貝抗原的局部可用性來決定的。因此，功能性親和力可以被視為一種協(xié)同作用，其中一個臂的結合會導致另一個臂結合動力學的變化。細胞膜上更高有效抗體濃度的親和力效應將取決于細胞密度和抗原表達水平。

當目標是最大限度地提高靶參與度，以拮抗靶抗原的生物功能時，功能性親和力可能是有利的。然而，當目標指向免疫系統(tǒng)時，如ADCC和ADCP，這種抗體二價的作用是非常有限的。實驗觀察表明，單價或具有較低內(nèi)在親和力的工程抗體可能更有效，表現(xiàn)出明顯增加的Emax，這是由于與細胞膜結合的抗體增加。

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二、抗體-抗原相互作用的調(diào)節(jié)

近年來，人們已經(jīng)探索出幾種調(diào)節(jié)抗體靶點結合的方法。通過提高抗體親和力或改變價態(tài)并引入額外的功能域來實現(xiàn)抗體與靶點的更強結合。

抗體序列工程化調(diào)節(jié)抗體靶親和力

抗體親和力調(diào)節(jié)的最早時間點是在抗體發(fā)現(xiàn)階段。傳統(tǒng)上，抗體親和力的調(diào)節(jié)可以通過體外噬菌體、酵母和哺乳動物基于展示的抗體發(fā)現(xiàn)模型來實現(xiàn)的。親和力調(diào)節(jié)可以通過使用這些方法進行親和力成熟來實現(xiàn)，引入突變以產(chǎn)生具有操縱靶結合親和力的突變庫，此外，可以通過引入更苛刻的洗滌條件來選擇高親和力抗體。

此外，通過體內(nèi)技術可以實現(xiàn)的高親和力抗體的發(fā)現(xiàn)。通過調(diào)節(jié)免疫方案，包括免疫抗原、佐劑、預處理、免疫方案、給藥途徑和靶生物的形式，以最大限度地刺激高親和力抗體的產(chǎn)生，然后通過B細胞克隆技術篩選高親和力抗體。進一步的創(chuàng)新包括使用表達人源抗體的轉基因動物，這些抗體能夠以高親和力結合靶點，并具有更大的臨床轉化前景。

基于AI的親和力優(yōu)化

二代測序（NGS）通過基于序列相似性和特征識別可能編碼高親和力抗體的核酸，增強了對高親和力抗體發(fā)現(xiàn)的能力，允許以前所未有的規(guī)模篩查編碼核酸的抗體。此外，人工智能和基于機器的學習（AI/ML）增強了NGS以更高的精度篩選更多高親和力結合序列的能力，并證明了其在抗體、基因聚類、從頭設計、優(yōu)化和調(diào)節(jié)結合親和力方面的能力。

通過抗體結構工程化調(diào)節(jié)靶點結合

除了靶親和力之外，通過改造天然單特異性形式之外的結構，可以增強抗體與靶的結合，包括在單個分子內(nèi)配對兩組不同的CDR以產(chǎn)生雙特異性抗體。此外，功能結構域的引入導致了更復雜的形式的發(fā)展，如三特異性抗體和免疫細胞因子。

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三、測量抗體-抗原相互作用的方法

準確測量抗體親和力，理解結合動力學，可以有效指導藥物開發(fā)�？贵w-抗原互相作用的測定方法大致可以分成兩大類：一類是把其中一個分子（通常是抗原）固定在芯片或者板子上，然后測定另一個分子（抗體）的結合參數(shù)，比如SPR、BLI。另一類是直接在活細胞上做實驗，看抗體怎么結合到細胞表面，比如流式細胞術、KinExA等等。

表面等離子共振（SPR）

SPR被廣泛用于實時測量抗體與固定抗原、補體或Fcγ受體的結合動力學。這種高通量、無標記的技術提供了對抗體-抗原結合動力學的詳細分析，包括結合率和解離率。通過固定任一結合伴侶。結合和解離事件會改變固定分析物的金膜芯片的折射率，從而導致可以實時測量的光散射強度的變化。

然而，在將體外和體內(nèi)發(fā)現(xiàn)相關聯(lián)時，SPR可能缺乏生理相關性。固定化的細胞表面抗原可能無法在細胞膜內(nèi)準確復制其三維結構，溶液中的天然抗原相互作用受到固定化的限制，從而限制了觀察到的相互作用自由度。此外，SPR中使用的緩沖條件可能無法準確反映pH、溫度或成分方面的生理結合環(huán)境。

流式細胞術

細胞計量學細胞結合試驗用于針對固定數(shù)量的表達靶抗原的細胞進行抗體滴定。這些檢測使用熒光標記的配體或標記的第二抗體來檢測結合，從而可以確定達到半數(shù)結合的濃度（EC50）和最大結合，這可以提供對抗體結合機制的見解。

設計細胞結合方法時有幾個考慮因素，包括配體耗竭和平衡。基于細胞術的檢測的其他局限性包括抗原：抗體復合物內(nèi)化，導致觀察到的抗體結合減少。

動力學排斥試驗

動力學排斥試驗（KinExA）是一種基于溶液的試驗，用于確定免疫復合物的結合伴侶濃度和平衡解離常數(shù)。在抗體親和力測量中，靶抗原被恒定濃度的抗體結合位點，使其平衡，隨后在流動中暴露于抗原包被的珠粒中。用熒光偶聯(lián)的二抗檢測珠捕獲的抗體，從而能夠在平衡時定量游離抗體并測定抗體親和力。由于這種測定通�？梢赃_到平衡，因此被認為更適合測量高親和力、亞納摩爾的相互作用。

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四、抗體親和力與功能的關系

抗體對其靶標的親和力通常被認為與其誘導藥理作用的能力密切相關。然而，這種相關性并不完全是線性的，并且高度依賴于所討論的特定藥理作用，以及它是否是由于靶細胞表面的靶占據(jù)或抗體密度引起的。

緊密結合及其對抗體功能的影響

高親和力抗體通常會與其靶抗原表現(xiàn)出“緊密結合”，其特征是當抗體濃度遠低于抗原濃度時，仍能有效結合，導致游離抗體被耗盡。通�？贵w親和力與其藥理學效果密切相關，但親和力與功能的關系并非總是簡單的線性關系，其取決于具體機制和效應來源。

拮抗性抗體

拮抗性抗體通過直接受體結合或隔離激活配體來破壞受體信號傳導。可以通過觀察靶受體激活的下游效應來評估它們的功能，包括從測量信號事件（如配體結合后不久的受體磷酸化）到對細胞增殖或表型的下游影響。通常靶標親和力和效力之間呈線性關系，更高親和力的抗體能夠在較低濃度下引發(fā)它們的作用。此外，這里可能存在一些表位依賴性，因為與受體結合結構域結合的抗體比與更遠端表位結合的抗體更有效。

免疫細胞接合器

參與抗體的免疫細胞涵蓋了廣泛的作用機制，所有這些機制都會誘導靶細胞的細胞毒性，例如通過ADCC、ADCP或CDC。除了這些傳統(tǒng)的Fc介導的效應器功能外，還包括了T細胞和NK細胞結合器，通過Fab介導的靶向特定效應細胞免疫受體來招募免疫細胞。

通常在這些復雜的作用機制中，親和力和功能之間的關系并沒有明確界定，其中抗體靶結合與補體或FcγR結合和/或免疫細胞結合是同時需要的。對于Fc依賴性細胞毒性機制，高親和力抗體可能導致雙價結合，占用兩個抗原但只提供一個Fc，降低效應細胞募集效率。相比之下，親和力較低的抗體更有可能以單價結合，導致更大的細胞調(diào)理、Fc呈遞，從而導致免疫細胞和補體募集。

雙特異性T細胞和NK細胞接合器的功能活性受TAA和T/NK細胞靶向域親和力的調(diào)節(jié)。對TAA的親和力必須足夠高才能與靶標結合，但必須仔細考慮對CD3的親和力，以平衡細胞毒性作用，同時降低與細胞因子釋放相關的風險。

激動劑抗體

激動劑抗體利用其二價性質促進其靶標在靶細胞膜或溶液中的聚集。通過這種方式，它們可以模仿天然存在的配體，誘導受體激活或靶標交聯(lián)。

抗體親和力和激動活性之間的關系尚未像拮抗抗體那樣得到廣泛的研究。一項研究調(diào)查了靶向三種不同受體（PD-1、CD40和4-1BB）的激動性抗體的親和力和功能關系，這些受體需要聚集才能引發(fā)其激動活性。該研究表明親和力和功能之間存在鐘形關系，低親和力而非高親和力是由更快的解離速率驅動的，導致最大的激動作用。此外，還觀察到除親和力之外的抗體的其他特性會影響體外效力，包括鉸鏈靈活性和對Fab構象的影響。

抗體偶聯(lián)藥物

ADC的結構很復雜，其功效受到其物理化學性質和生物學特征的影響，如細胞內(nèi)化、有效載荷釋放和有效載荷的作用機制。連接子-有效載荷與抗體的結合，無論是通過共價還是非共價修飾，都會改變ADC的物理化學特性。

一般來說，高親和力可能提高細胞內(nèi)吞和載荷釋放效率，但也可能增加脫靶毒性。而低親和力可能減少脫靶結合，但也可能降低腫瘤細胞攝取效率。親和力的選擇需要平衡靶向性、內(nèi)吞、載荷釋放和安全性等各方面。

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結語

抗體結合定量技術的快速發(fā)展為精準治療和藥物研發(fā)開辟了新的可能性。通過對抗體親和力與功能性親和力的深入理解與優(yōu)化，結合AI技術、序列工程和功能域設計，我們不僅能夠提升抗體的治療效力和靶向性，還能顯著降低副作用風險。未來，隨著跨學科技術的融合與創(chuàng)新，抗體療法有望在癌癥、自身免疫疾病和感染性疾病等領域實現(xiàn)更突破性的進展，最終為患者提供更安全、更個性化的治療方案。這一領域的持續(xù)探索，將深刻影響生物醫(yī)藥的發(fā)展方向與臨床實踐。

參考資料：

1.Quantifying antibody binding: techniques and therapeutic implications. MAbs. 2025 Feb 16;17(1):2459795

       原文標題 : 抗體結合定量的技術進展與治療意義