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引言

近年來，雙特異性抗體已成為一種關(guān)鍵的藥物形式，它們能夠?qū)崿F(xiàn)傳統(tǒng)單特異性抗體難以實(shí)現(xiàn)的獨(dú)特功能。例如，T細(xì)胞接合器和能夠模擬凝血因子VIII的emicizumab。因此，雙抗具有相當(dāng)大的治療潛力。然而，雖然IgG型的雙抗可以在研究規(guī)模上成功產(chǎn)生，但由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，它們作為藥物制劑的商業(yè)制造一直面臨著重大挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)以多種方式表現(xiàn)出來：控制表達(dá)的困難，實(shí)現(xiàn)高純度純化的障礙，以及高昂的生產(chǎn)成本，所有這些都阻礙了它們成功轉(zhuǎn)化為臨床可行的候選藥物。今天，我們就來回顧一下IgG型雙特異性抗體鏈交換技術(shù)的發(fā)展和最新進(jìn)展。

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一、IgG型雙抗的復(fù)雜性和早期純化策略

四鏈雙特異性抗體有兩條不同的重鏈，分別負(fù)責(zé)識(shí)別兩個(gè)不同的靶點(diǎn)，還有兩條不同的輕鏈來配合它們結(jié)合靶標(biāo)。當(dāng)細(xì)胞在同時(shí)表達(dá)這四種基因并進(jìn)行組合時(shí)，會(huì)產(chǎn)生十種可能的組合！而正確配對(duì)的只是其中一種，剩下的九種都是錯(cuò)誤配對(duì)的雜質(zhì)。此外，這十種組合，分子量、電荷性質(zhì)都差不多，幾乎無法用普通的色譜柱把它們分開！因此，早期雙抗的工業(yè)化生產(chǎn)相當(dāng)困難。

面對(duì)這十種組合，人們一開始使用的是抗原固定化親和層析。也就是把雙抗結(jié)合的兩種抗原分別固定在兩根柱子上。先把細(xì)胞培養(yǎng)液過第一根柱子，雙抗會(huì)跟抗原1結(jié)合被留下來，去除其它雜質(zhì)。然后用特定條件把雙抗洗下來，再過第二根裝了抗原2的柱子，雙抗又會(huì)跟抗原2結(jié)合被留下，再洗脫。這樣理論上就能得到純的雙抗了。這種方法雖然有效，但是這些抗原蛋白往往受不了堿性條件，柱子壽命短，再利用率低，生產(chǎn)成本很高。

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二、鏈配對(duì)技術(shù)的突破

如何既要讓細(xì)胞更容易產(chǎn)生我們想要的雙抗，又能讓后續(xù)的純化過程更簡單、更高效呢？科學(xué)家們經(jīng)過不斷的探索，獲得了很多技術(shù)突破，包括了三種抗體工程技術(shù)：通用輕鏈，調(diào)整等電點(diǎn)，以及促進(jìn)正確的重鏈二聚化。

通用輕鏈

通用輕鏈就是把不同的重鏈組合分別跟它們各自的原配輕鏈一起表達(dá)，看看哪些組合還能保持活性，從中篩選出一個(gè)相對(duì)靠譜的通用輕鏈。找到之后，在用FR（CDR）shuffling的方法，對(duì)這個(gè)通用輕鏈進(jìn)行微調(diào)，確保它跟兩個(gè)重鏈都能很好的匹配。這種方法可行，但是篩選過程非常耗時(shí)耗力，而且通用輕鏈往往是妥協(xié)的結(jié)果，可能對(duì)其中一個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合不完美，甚至犧牲掉一部分活性。

等電點(diǎn)工程

蛋白質(zhì)在溶液中會(huì)帶有電荷，這個(gè)電荷特性可以用等電點(diǎn)pI來衡量。不同的蛋白質(zhì)，pI值不一樣，在離子交換色譜柱上的行為也就不同。這種技術(shù)的思路是，在其中一個(gè)重鏈的可變區(qū)VH上引入一些氨基酸突變，人為地改變這個(gè)雙抗的pI值，讓它跟那些錯(cuò)誤配對(duì)產(chǎn)生的單抗的pI值拉開差距。這樣一來，它們?cè)陔x子交換柱上的保留時(shí)間和洗脫順序就不一樣了，很容易就把它們分開。通常這個(gè)步驟會(huì)放在Protein A純化之后，作為最后的精致步驟，進(jìn)一步提高純度。

重鏈異源二聚化

促進(jìn)重鏈異源二聚化。就是讓正確的兩個(gè)不同重鏈優(yōu)先結(jié)合，形成我們想要的異源二聚體。人們已經(jīng)開發(fā)了許多方法，一種經(jīng)典的方法叫Knobs into Holes，簡稱KiH。就是在兩個(gè)不同重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域上進(jìn)行突變，讓它們像齒輪一樣必須互相咬合才能穩(wěn)定結(jié)合。另一種方法是利用電荷排斥或吸引，比如使用E356K和K439E突變，通過引入帶相反電荷的氨基酸對(duì)，來引導(dǎo)正確的重鏈配對(duì)，并排斥掉同源的重鏈。

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三、鏈配對(duì)技術(shù)平臺(tái)

利用這些技術(shù)，研究者們開發(fā)了不同的技術(shù)平臺(tái)，比如中外制藥開發(fā)的FAST-Ig技術(shù)，羅氏的CrossMab技術(shù)平臺(tái)以及可控Fab臂交換技術(shù)（cFAE）。

FAST-Ig

FAST-Ig的全稱是Favored Assembly by Specific electrostatic interactions for Ig，翻譯過來就是通過特定的靜電相互作用來實(shí)現(xiàn)抗體的優(yōu)選組裝。這個(gè)技術(shù)的核心在于，它不依賴于找一個(gè)通用的輕鏈，而是直接在重鏈和輕鏈的結(jié)合界面，以及重鏈之間的界面上，精確地引入一些帶相反電荷的氨基酸。比如，在重鏈和輕鏈的接觸點(diǎn)放一對(duì)正負(fù)電荷，強(qiáng)制它們必須正確配對(duì)才能結(jié)合；在重鏈之間也放類似的設(shè)計(jì)，促進(jìn)它們形成異源二聚體。這樣一來，就像給正確的組裝過程加了導(dǎo)航和助推器，大大減少了錯(cuò)誤配對(duì)的可能性。

CrossMab

CrossMab是由羅氏公司開發(fā)的技術(shù)平臺(tái)。這種方法在Knobs-into-holes方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步解決了輕鏈錯(cuò)誤配對(duì)的問題，簡單的說，這項(xiàng)技術(shù)首先在Fc區(qū)設(shè)計(jì)了KiH異源二聚體連結(jié)，同時(shí)將Fab區(qū)域的CH1和CL互換，通過氨基酸序列的互換，使得同源區(qū)域，比如VH與VH、CH1與CH1產(chǎn)生空間位阻，從而減少輕鏈錯(cuò)配。Crossmab主要有3種類型，crossmab-fab，重鏈交換整個(gè)Fab區(qū)作為新的"輕鏈"，原來的輕鏈作為新的"重鏈"連接到Fc鉸鏈區(qū)。Crossmab-VH-VL，這種類型僅交換可變區(qū)。Crossmab-CH1-CL，這種類型僅交換恒定區(qū)。

可控Fab臂交換

我們體內(nèi)的IgG有4個(gè)亞型，其中的IgG4有一個(gè)特殊的能力，就是它的兩個(gè)Fab臂可能會(huì)在體內(nèi)隨機(jī)地跟別的IgG4分子的Fab臂互換，結(jié)果就是原本只結(jié)合單個(gè)抗原的IgG4，可能變成一個(gè)能結(jié)合兩個(gè)抗原的雙價(jià)形式。IGG4的這種Fab臂交換過程由氧化還原條件控制，IgG4的兩個(gè)特征使Fab臂交換得以發(fā)生，鉸鏈區(qū)中的228位的絲氨酸和CH3結(jié)構(gòu)域中409位的精氨酸。前者通過二硫鍵導(dǎo)致兩條重鏈之間異常不穩(wěn)定的共價(jià)相互作用，后者通過CH3結(jié)構(gòu)域削弱了兩條重鏈之間的非共價(jià)結(jié)合。

通過工程化改造，我們就可以控制IGG的Fab臂交換，也就是cFAE技術(shù)。它的核心思路非常巧妙，不需要?jiǎng)涌贵w的Fab臂部分，只需要在兩個(gè)不同抗體的CH3結(jié)構(gòu)域上，分別引入一對(duì)特定的突變，比如一個(gè)抗體上是F405L，另一個(gè)是K409R。這兩個(gè)突變使各自的同源二聚體抗體不穩(wěn)定，在還原劑的作用下解離，然后它們就更傾向于跟對(duì)方那個(gè)帶有互補(bǔ)突變的抗體結(jié)合，形成異源二聚體。

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結(jié)語

雙抗這種神奇的分子，要想從實(shí)驗(yàn)室走向臨床，背后離不開兩大支柱。一個(gè)是不斷精進(jìn)的抗體工程技術(shù)，負(fù)責(zé)讓這些復(fù)雜的分子能夠被高效、穩(wěn)定地生產(chǎn)出來；另一個(gè)就是日益成熟的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，負(fù)責(zé)把這些粗制的原料提純成符合標(biāo)準(zhǔn)的藥品。兩者缺一不可。未來，隨著這兩方面技術(shù)的深度融合，我們有理由相信，雙抗的開發(fā)風(fēng)險(xiǎn)會(huì)大大降低。

參考文獻(xiàn)：

1.Discovery and development of bispecific antibodies. Protein Expr Purif. 2025 Aug 5:236:106787

       原文標(biāo)題 : 雙特異性抗體的鏈配對(duì)技術(shù)