BACKGROUND INTRODUCTION

利用豐富廉價的碳源可以有效降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟可行性。其中，醋酸鹽就是一種非常有前途的碳源，通常以較高濃度存在于廢物和生物質的水解產(chǎn)物中。

衣康酸學名為甲叉琥珀酸，亞甲基丁二酸，是不飽和二元有機酸。它含不飽和雙鍵，具有活潑的化學性質，可進行自身間的聚合，也能與其他單體如丙烯腈等聚合；能進行各種加成反應，酯化反應和聚合反應，是化學合成工業(yè)的重要原料，也是化工生產(chǎn)的重要原料，可用作酸味劑、pH調節(jié)劑、金屬螯合劑等。

在2004年，美國能源部將衣康酸評選為12種最具發(fā)展?jié)摿Φ纳�物質來源平臺化合物之一。衣康酸主要通過絲狀真菌土曲霉（Aspergillus terreus）的發(fā)酵產(chǎn)生。然而，由于發(fā)酵過程復雜、菌體生長緩慢、蛋白酶系統(tǒng)復雜、發(fā)酵過程持續(xù)需氧量高、生產(chǎn)成本高、副產(chǎn)物難以控制，以及缺乏有效的基因工程工具等因素，導致土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸水平受到了限制，40余年里產(chǎn)量都沒有明顯的提升。隨著基因工程、合成生物學及系統(tǒng)生物學的飛速發(fā)展，越來越多的研究者將目光聚焦于其他底盤細胞，將衣康酸合成途徑構建在異源細胞中，如大腸桿菌、酵母細胞和谷氨酸棒狀桿菌等，以期提升工業(yè)衣康酸的產(chǎn)能。

2018年，韓國浦項科技大學（Pohang University of Science and Technology）的Myung Hyun Noh等人，在《Biotechnology and Bioengineering》雜志（IF3．952；工程技術2區(qū)）發(fā)表了題為“Production of itaconic acid from acetate by engineering acid－tolerant Escherichia coli W ”的文章。

所用到的主要方法

METHODS

1．HPLC：采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。適用于溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性的限制，用途廣泛。

2．LC－MS：質譜分析是先將物質離子化，按離子的質荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強度而實現(xiàn)分析目的的一種分析方法。液質連用實現(xiàn)對復雜混合物更準確的定量和定性分析。而且也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。

3．real－time PCR：是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。該技術已經(jīng)被廣泛用于監(jiān)測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異。

4．異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）測定：ICL催化異檸檬酸降解為乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm 下有特征吸收峰，監(jiān)測340nm吸光度的減小速率可間接反應ICL 活性。

ABSTRACT

利用豐富廉價的碳源可以有效降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟可行性。醋酸鹽是一種很有前途的碳源，可以實現(xiàn)經(jīng)濟有效的微生物轉化過程。在這項研究中，作者設計了一種從醋酸鹽生產(chǎn)衣康酸的大腸桿菌菌株。由于已知醋酸鹽抑制細胞的生長，作者首先篩選出具有高度耐受醋酸鹽特性的大腸桿菌菌株，并最終選擇W菌株作為后續(xù)研究所用的宿主。隨后，通過使用合成的啟動子和5＇UTR（非翻譯區(qū)）來過表達cad基因（編碼順烏頭酸脫羧酶）獲得WC菌株。然而，由于醋酸鹽吸收低，WC菌株僅產(chǎn)生0．13g ／ L衣康酸。為了改善產(chǎn)量，進一步通過途徑基因的過表達以及其失調來擴增乙酸（即醋酸）同化途徑和乙醛酸分流途徑。所得菌株WCIAG4在用醋酸鹽為唯一碳源發(fā)酵88小時后，可產(chǎn)生3．57g ／ L衣康酸（理論最大產(chǎn)率的16．1％）。這一研究也表明：醋酸鹽可以成為工程化大腸桿菌生物化學生產(chǎn)的潛在原料。