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引言

自19世紀末現代藥物發(fā)現以來，在一系列關鍵技術突破的促進下，藥物發(fā)現的方法和藥物模式方面都發(fā)生了重大變化。20世紀50年代建立的X射線晶體，開創(chuàng)了未來幾十年基于結構的藥物設計。20世紀70年代重組DNA和雜交瘤技術的發(fā)現使得第一種重組蛋白療法成為可能，例如來自禮來/基因泰克的Humulin和來自Amgen的Epogen，以及第一個單克隆抗體藥物，Orthoclone OKT3。這些技術啟動了一種新的生物藥形態(tài)，目前，單克隆抗體已成為治療開發(fā)中最受歡迎的藥物形式。

然而，單克隆抗體單一靶向的局限性和不斷增長的未滿足的臨床需求，促使研究人員進一步研究具有多特異性的分子。多特異性抗體（MsAbs）能夠識別位于相同或不同靶標上的兩個或多個表位，這種多重識別能力擴展了常規(guī)單克隆抗體的功能，允許多種應用，例如募集免疫細胞破壞腫瘤細胞或交聯不同的細胞表面蛋白。

MsAbs通常在其結合模塊的大小，構型，價態(tài)，靈活性和接近角度以及它們的可開發(fā)性，分布和藥代動力學屬性方面有所不同。自然界現有的能夠結合的蛋白質，如抗體和細胞因子，提供了有價值的結合模塊，其序列和折疊經過數百萬年的優(yōu)化。相比之下，人造模塊，如小蛋白和從頭合成蛋白，通過使用Alphafold2和Rosettafold等工具預測蛋白質結構，也證明了人工合成轉化藥物發(fā)現的潛力。

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一、Fab

設計MsAbs的一種簡單而簡約的方法是使用IgG的Fab部分。Fabs由HC的VH和CH1結構域以及整個LC（VL和CL）組成，形成了一個非常穩(wěn)定的異二聚體，其中大約100個殘基參與了多個穩(wěn)定接觸，包括氫鍵、鹽橋、疏水相互作用和范德華力。

此外，與scFv形成鮮明對比的是，Fab表面親水，易于暴露于溶劑，因為它從IgG中提取只需要在連接CH1和Ab鉸鏈的柔性接頭處進行截斷。因此，穩(wěn)定的蛋白質核心和巨大的親水表面使Fabs成為組裝MsAbs的流行選擇，特別是對于高濃度和/或皮下給藥（SC）配制的藥物。然而，由兩條不同的多肽鏈組成的模塊需要異二聚體組裝，這是含有兩個或多個不同Fab的MsAbs的重要考慮因素，因為必須保證每個HC和LC的正確同源配對。由于異源IgG分子的單細胞表達可以產生多達10種不同的錯配物種，因此人們開發(fā)了許多工程化策略來實施正確的鏈配對，比如電荷配對突變（CPM），knob-into-hole（KiH）和單鏈Fabs（scFabs）等）。另一種方法涉及使用通用LC。這些通用LC可以與兩個或多個不同的HC配對。

目前，臨床試驗中的MsAbs有大約58%含有至少一個Fab作為構建模塊。此外，首批獲得美國食品和藥物管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）批準的MsAbs之一，用于治療血友病的emicizumab，其中包含兩個共享一個共同LC的Fab。

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二、ScFv

scFv是通過靈活接頭連接重鏈（VH）和輕鏈（VL）可變區(qū)而產生的分子。最常見的接頭是（Gly4Ser）3，連接序列也可以定制為更具剛性甚至帶靜電。此外，scFv分子中的VH-VL或VL-VH取向影響該模塊的結合和可行性。scFv目前也是制備MsAbs非常有吸引力的模塊，因為單個多肽鏈避免了鏈配對的復雜性，并且大約只有Fab大小的一半。此外，它們可以使用多種接頭串聯融合到Fc的N和C末端和/或進行兩到四個拷貝的串聯。

但是，由于該模塊缺少Fab的恒定區(qū)域CH1和CL，因此也不存在CH1-CL界面C末端的天然二硫鍵。盡管蛋白質接頭可以幫助克服scFv在純化和儲存過程中固有的不穩(wěn)定性，但由于動態(tài)VH/VL界面，熱穩(wěn)定性平均低于親本Fab。為了解決這個問題，可以增加二硫鍵來加強這個界面并提高熱穩(wěn)定性。但同時也會使許多Fab在轉化為scFv時無法保留功能。目前，可以通過計算蛋白質設計來鑒定改善穩(wěn)定性的定制二硫鍵。

另外，scFv缺乏CH1/CL區(qū)域，動態(tài)的VH/VL界面成為一個具有聚集傾向的關鍵區(qū)域。聚集通常與分子濃度相關，因此當達到像抗體一樣的濃度時，含有scFv的MsAbs可能表現出較差的單分散性，因此限制了治療產品的開發(fā)應用。但是，其簡單平臺技術的吸引力加上開發(fā)周期后期才會考慮的技術問題，導致許多含有scFv的MsAbs進入臨床。目前，正在臨床開發(fā)的MsAbs中約有36%含有至少一種scFv作為模塊之一，其中blinatumomab是來自Amgen的兩種scFv串聯分子，于2014年獲得FDA批準。

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三、納米抗體（VHH）

除IgG外，駱駝和鯊魚天然產生重鏈抗體，其中抗原結合區(qū)由重鏈（VHH）的單個可變結構域組成。此外，VHH也可以在表達人源化VHH的轉基因小鼠模型中產生，或者通過展示技術篩選。這些VHH，也稱為納米抗體或單域抗體（SDAb），在MsAbs的組裝中具有巨大的優(yōu)勢：首先，它繞過了Fabs中同源HC/LC配對的需要，并避免了互連接頭的使用，例如scFv。此外，由于其12-15 kDa的緊湊結構，VHH顯示出理想的可開發(fā)性屬性，包括高產量，在高蛋白質濃度低聚集，低粘度和高熱穩(wěn)定性。由于其絕佳的生物物理特性，VHH可能適合吸入給藥，因為它們的小尺寸確保了體循環(huán)中的半衰期短。此外，VHH的結合親和力可以高達皮摩爾級，即使沒有VL，也與最佳Fab或scFv分子的結合親和力相匹配。盡管最初對VHHs的非人源存在疑慮，但隨著2019年FDA批準caplacizumab，這些問題迅速得到緩解。模，進入臨床開發(fā)階段開發(fā)的MsAbs約有10%含有VHH作為模塊之一。-

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四、抗體Fc

MsAbs極大地受益于Fc在部署鏈配對技術時異二聚化的能力。Fc異二聚化的兩種流行方法是使用KiH突變和CPM。KiH突變引入一個空間龐大的氨基酸，如一條鏈上的色氨酸或酪氨酸，另一條鏈上的小氨基酸如甘氨酸或丙氨酸，分別形成突起和口袋。雖然這種方法對于減少同型二聚體特別有效，但空穴同型二聚體仍然可以形成，并且必須通過額外的純化步驟與所需的異二聚體分離。相反，CPM在一條鏈上引入帶正電荷的殘基，在另一條鏈上引入帶負電荷的殘基，以促進異二聚體的形成。這使得Fc成為產生需要不對稱形式分子的引擎，因為不同的模塊可以連接到Fc的每一半的N和C端。此外，含有Fc的MsAbs，具有更高的表達產量和高溶解度，且易于通過蛋白A捕獲純化。最后，Fc可以識別多種細胞表面上的幾種受體，可以對其進行操作以改善功能。 毫不奇怪，目前在臨床試驗中大部分MsAbs，約83%都含有Fc。更多FC工程化的細節(jié)可以參閱《抗體Fc工程化改造策略概覽》

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五、細胞因子

免疫系統(tǒng)擁有一系列復雜的細胞類型，這些細胞類型由一類分泌的細胞外信號蛋白（細胞因子）精心控制，通常小于30 kDa。迄今為止，已經鑒定出100多種不同的細胞因子，每種細胞因子都具有獨特的免疫生態(tài)位，它們代表了一個現成的模塊庫，可以用于治療。毫不奇怪，目前在臨床試驗中約有超過14%的MsAbs中攜帶細胞因子。然而，這些細胞因子通常表現出狹窄的治療窗口，主要是由于高毒性特征。這表明，為了發(fā)揮這些細胞因子的全部潛力，必須改善毒性特征。

細胞因子的可開發(fā)性

當重組表達時，許多細胞因子表現出聚集傾向，這會影響CMC，和潛在的免疫原性。這可能是由于大多數細胞因子由螺旋束基序組成并顯示多個結合界面，這通常為富含疏水性斑塊，這可能導致聚集。另一個是游離半胱氨酸的情況。IL-1家族顯示出多種游離半胱氨酸，使其易于通過非經典二硫鍵聚集和/或在暴露于氧化環(huán)境的情況下導致效力降低。因此，需要引入了新的C到S替代來緩解這些問題。例如，臨床上大多數IL-2分子都含有C125S突變，這對于避免開發(fā)過程中的聚集至關重要。

調節(jié)細胞因子選擇性

細胞因子受體在不同細胞類型上以不同水平表達，通過調節(jié)細胞因子受體親和力提供了偏向細胞類型的機會。例如IL-2，減弱與亞基IL-2Rα的結合減少了免疫抑制性Treg細胞的活化，導致更高的T效應細胞活化。Neoleukin Therapeutics開創(chuàng)了一種新的策略，通過設計具有定制功能和增強可開發(fā)性的從頭合成細胞因子，比如Neo-2/15，將從頭合成的螺旋移植到天然IL-2骨架上，完全消除了與IL2Rα的結合，同時在這種螺旋束蛋白上建立了額外的穩(wěn)定性。

調節(jié)細胞因子的靶向性

全身細胞因子信號傳導的毒性促使這些細胞因子與其他靶向分子偶聯，目的是降低外周細胞因子活性。這些與細胞因子融合的模塊試圖將細胞因子定位于腫瘤微環(huán)境，并通過識別選定的腫瘤相關抗原（TAA）來降低外周活性。例如，羅氏已經證明了與IL-2突變蛋白融合的TAA的幾個成功例子，包括PD-1，腫瘤抗原癌胚抗原（CEA）和成纖維細胞活化蛋白-α。

但是，為了使靶向方法產生效果，它必須驅動綁定事件的順序。因此，確保識別TAA的模塊的結合親和力顯著高于細胞因子與其受體的親和力是關鍵。這通常對細胞因子進行突變，以減弱結合親和力。

細胞因子的條件性激活

條件性激活策略試圖通過依賴于響應組織特異性線索（即蛋白酶切割，靶標重建，pH變化，小分子誘導的變構）的蛋白質生物傳感器來降低系統(tǒng)活性。例如，通過將肽甚至靶向受體與細胞因子融合來“掩蓋”促炎細胞因子活性。一旦這些分子到達靶組織，通常通過切割編碼腫瘤特異性蛋白酶的接頭來釋放細胞因子的完全活性。一個案例是與異二聚體Fc融合的IL-2突變蛋白，該異二聚體Fc通過金屬蛋白酶（MMP）可切割接頭攜帶融合在Fc N末端的IL2和IL-2Rβ。

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六、微小蛋白

雖然基于抗體的療法一直是主要的生物制劑，但其他類別的蛋白質也在探索中。從歷史上看，使用非Ig或“替代”模塊的動機通常是為了克服天然模塊的局限性，如穩(wěn)定性差、組織滲透性差、無法靶向細胞內蛋白質或藥物輸送途徑（即靜脈注射）等。除了為這些缺點提供解決方案外，非Ig 模塊作為治療劑本身可能會提供不同的藥代動力學和藥效學特征，并可以獲得天然模塊無法獲得的靶結合界面。

通常，這些替代支架是來源于具有所需特性的蛋白質的單結構域。來源的蛋白可能是人類、細菌、無脊椎動物，甚至是從頭設計的，大小范圍從4kDa到20kDa。

Monobodies, pronectins 和adnectins

與免疫球蛋白最相似的是Monobodies, pronectins 和adnectins，每個都包含一個纖連蛋白3型（TNF3）結構域，由七條柔性環(huán)連接的反平行β鏈組成。通常，這些柔性環(huán)中的三個是多樣化的，用于以類似于抗體CDR的方式結合。這些特征使它們能夠作為不同靶標的結合物，比如BMS-986089，一種adnectin-Fc融合，目前正處于脊髓性肌萎縮癥的III期臨床試驗。

Anticalins

Anticalins基于脂質運載蛋白家族，參與親脂性物質的細胞外運輸。它們具有一個β折疊桶狀結構，具有一個內腔和四個高度靈活的環(huán)。脂質運載蛋白與免疫球蛋白可變區(qū)的結構相似性使其可以對柔性環(huán)進行工程化設計，以靶向各種治療靶點。一個利用Anticalins結合的例子是PRS-343，一種目前處于II期臨床試驗中的41BB/HER2雙特異性靶向藥物。

Affibodies

Affibodies是葡萄球菌蛋白A的衍生物，是少數細菌來源的模塊之一。它是一個高度穩(wěn)定的三α螺旋束結構，其螺旋表面經過重新設計，可以用于靶向。Affibodies的分子量約為6.5 kDa，是最小的模塊之一。這種較小的尺寸可能使其能夠靶向其他較大模塊無法到達的表位。然而，作為一種細菌蛋白，免疫原性可能是個問題。

DARPin

DARPin是由兩個反平行α螺旋單元組成的模塊化蛋白，相鄰單元由β發(fā)夾連接。每個模塊單元由33個殘基組成，完整的蛋白可以由多達29個連續(xù)的重復單元組成，最常見的長度是4到6個單元。這些蛋白與富含亮氨酸的重復蛋白有關，通常存在于脊椎動物先天免疫系統(tǒng)的Toll樣受體中。與其他模塊的結合界面相比，DARPin界面具有很高的剛性，形狀最凹，這使得DARPin可能成為針對某些靶標的更合適的結合支架。由DARPin組成的MsAb的一個例子是MP0250，這是一種由四個DARPin組成的單鏈三特異性分子。目前，它正處于針對多種適應癥的II期臨床試驗中。

Knottins

Knottins是長度通常為30至50個氨基酸的短肽，具有由三個二硫鍵形成的高度穩(wěn)定的保守折疊。這組成了一個剛性支架，其中包含許多多樣化的柔性環(huán)。由于其體積小，Knottins會迅速從體內清除。結蛋白是用于產生結合劑的最小模塊，有可能靶向一些蛋白上原本無法接近的表位。然而，迄今為止，絕大多數Knottins因其半衰期短而被用作診斷劑，尚未用于MsAbs。 

從頭合成的微小蛋白

從頭合成的蛋白質設計使用基于生物物理特性和預定蛋白質結構的大數據集的預測算法指導的計算工具來生成人造蛋白質折疊，甚至是具有自然界中沒有的氨基酸序列的完整蛋白質。從頭開始的微小蛋白是一類新的、快速發(fā)展的模塊形式，有可能加速功能性MsAb的發(fā)現。然而，從頭合成的小蛋白應該被視為一把雙刃劍：一種具有更快時間線、優(yōu)化可開發(fā)性、新功能或定制條件激活潛力的高度動態(tài)模塊，但也是一種由幾乎沒有人類同源性的氨基酸序列組成的具有固有免疫原性風險的模塊。Neo-2/15就是一種最具體內特征的新生微小蛋白，模擬人類IL-2。

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結語

多特異性抗體無疑是下一代生物藥的重要方向，它們潛力巨大，但也面臨著前所未有的復雜性和開發(fā)挑戰(zhàn)。要真正邁向下一代，關鍵在于深刻理解我們使用的各種構建模塊的特性，以及它們成功組裝成復雜四級結構的內在規(guī)則。這意味著，我們在選擇這些模塊時，不僅要考慮它能做什么，還要考慮它本身的表達、穩(wěn)定性、純化難易度、與其他模塊的兼容性等等。

同時，我們也要認識到，計算蛋白設計，特別是機器學習的革命性整合，正在為這個領域帶來前所未有的機遇。通過將這些智能工具融入到工作流程中，我們有望實現更智能、更高效、更可預測的多特異性抗體開發(fā)，最終更快地將這些能解決未滿足醫(yī)療需求的創(chuàng)新療法帶給患者。

參考資料：

1.Next generation of multispecific antibody engineering. Antib Ther. 2023 Dec 8;7(1):37–52

       原文標題 : 下一代多特異性抗體的構建模塊